Kuidas DNA järjestamine töötab

DNA järjestamine on väga-väga lihtne: seal on molekul, sa vaatad seda, kirjutad üles, mida leiad. Võib arvata, et see on lihtne - ja ongi. Probleem pole mitte DNA molekuli ahela iga lüli keemilise identiteedi uurimises ja kontrollimises, vaid nende identiteetide kontrollimises kümneid miljoneid kordi, tehes sisuliselt vigu. Seda on see, mis on raske, kuid DNA olemus on selline, et kui teil on ainult 95% õigest järjestusest, võib teil ka üldse mitte midagi olla. Niisiis, kuidas teadlased tegelikult loevad bioloogia kavandeid ja loovad koos nendega tohutu osa kaasaegsest meditsiinist ja biotehnoloogiast?



Kõik algas enam-vähem ühe kutiga nimega Frederick Sanger. Sanger lõi geniaalse meetodi DNA molekuli lugemiseks, milleks kasutati DNA-aluste spetsialiseeritud versiooni, mida nimetatakse dDNA-ks või di-deoksü-ribonukleiinhappeks. ’Di’ viitab asjaolule, et dDNA alused on ilma mõlemad RNA alustel leitud -OH rühmadest, samas kui tavalisel deoksü-ribonukleiinhappel (DNA) on see endiselt olemas. Normaalsetes DNA-alustes toimib see üksik -OH-rühm järgmise molekuli ahela kinnituskohana. Ilma omaette ei saa dDNA-alused moodustada DNA-le iseloomulikke ahelaid, nii et nad lõpetavad mis tahes ahelakasvuprotsessi, kui nad on ühendatud kasvavasse DNA ahelasse. Sanger mõistis, et suudab ära kasutada seda dDNA-aluste kalduvust mis tahes ahela pikenemisprotsessi peatamiseks, et näha ahela enda järjestust.

DNA järjestamise kiirus on hüppeliselt kasvanud, kuid kas see trend võib jätkuda?

DNA järjestamise kiirus on hüppeliselt kasvanud, kuid kas see trend võib jätkuda?



Teeme kiire mõttekatse: Oletame, et mul on 4-alust DNA molekuli järjestusega ATGC, kuigi ma seda järjestust ei tea ja tahaksin. Ma tean, et DNA-d saab panna ennast üsna lihtsalt kordama; lihtsalt soojendage seda niikaugele, et topeltheeliks 'sulab' kaheks eraldi ahelaks ensüümide juuresolekul, mis kinnitavad neile vabalt hõljuvaid DNA aluseid, ja lõpuks saate lõpuks kaks eraldi topeltheeliksit, kus teil algselt üks oli. Aga mis siis, kui vabalt hõljuvad alused, mis on nendele üksikutele ahelatele kinnitatud, on segu tavalistest DNA alustest ja “terminaalsetest” dDNA alustest?

Noh, sel juhul saaksime segu toodetest, sõltuvalt sellest, kuhu kasvukettides meie fluorestsentsmärgistatud terminaalsed dDNA-alused lõpuks sisestati. Meie ATGC molekuli jaoks oleksid mõned replikeeritud ahelad täispikad ja märgistamata - ühtegi dDNA-alust ei juhtunud üldse sisestama. Kuid me jõuaksime ka mõne ühealuselise ahelaga, mis lõpevad dDNA alusega C - ainult üks A-C aluspaar. Veel kasulikum oleks see, et saaksime segu kahest alusest, mis lõpevad märgistatud G-ga, kolme-alustest kiududest, mis lõpevad märgistatud T-ga, ja nelja-alustest ahelatest, mis lõpevad märgisega A. See annab meile CGTA loetud järjestuse , mis tähendab, et algne komplementaarne järjestus oli ATGC.



Kuid isegi selle protsessi automatiseerimine jäi liiga aeglaseks, et võimaldada sellist populatsiooniskaala metaanalüüsi, mida kaasaegne meditsiin ja genoomika nõudsid. Seal tulid nn massiliselt paralleelsed järjestused, mida kõnepruugis nimetatakse mõnikord ka püsside järjestamiseks. See viitab põhimõtteliselt ideele, et kui lõhustate pika DNA järjestuse väiksemateks fragmentideks, saate neid kõiki korraga lugeda. Peate lugema palju-palju koopiaid oma üldisest proovist, kuna peate võtma need killustatud andmed ja käivitama mõistatuse sarnase algoritmi, et välja selgitada, kuidas nad üldse koos läksid.

Selexa järjestamine, lihtsustatud.

Selexa järjestamine, lihtsustatud.

Kõige populaarsem neist püssimeetoditest oli tõenäoliselt Solexa, mis nägi DNA lagunemist ja kleepumist klaasplaadile. Protsessis kasutatakse pöörduvalt terminalaluseid - aluseid, mis seiskavad ahela kasvu protsessi mõneks ajaks , kuni teadlased otsustavad need blokeerida ja lubavad järgmise lingi lisada. Range lisamise, lugemise ja blokeerimise tsükkel võimaldab teadlastel teha hetkeseis paljude miljonite fragmentide kohta, lugedes igaühe lõpus olevat alust, enne kui lubada lisada veel üks ajutiselt terminalibaas ja teha uus hetktõmmis.

Massiivselt paralleelsed järjestused muutsid mängu genoomika uurijate jaoks, kuid see on samm isegi nende tehnikate järel, mis võib rahvatervises pöörde muuta, muutes tohutu järjestamise kiiruse palju taskukohasemaks ja praktilisemaks. Selleks on mitu konkureerivat pakkumist, kuid nad kõik üritavad DNA replikatsiooniprotsessi täielikult eemaldada - nn DNA-molekuli nn otsest lugemist, ilma et oleks vaja DNA segaseid, nõudlikke ja aeganõudvaid reaktsioone ensüümidega.

MinION USB-mälupulga DNA järjestaja

Järgmise põlvkonna DNA järjestajad on rohkem kui lihtsalt kiired - need on praktilised.



Neist varaseimatest tehnoloogiatest on kõige edukam nanopooride järjestamine. See meetod toidab tegelikult DNA ahela läbi juhtivas materjalis oleva poori. Kui alused liiguvad selle nanopooriga läbi, venitavad nende veidi erinevad suurused poore iseloomuliku koguse - ja see pooride mehaanilise pinge muutus tähendab elektrijuhtivuse muutust. Lugedes juhtivuse muutusi, kui DNA ahel toidetakse läbi nanopooride, saavad need sekvenaatorid vanade replikatsioonireaktsioonide kaotada.

See on oluline, sest leiutatakse üha rohkem DNA-tehnoloogiaid, mis võivad aidata haiglatele ebasoodsas keskkonnas töötajaid või lihtsalt miljoneid perearste kogu maailmas, kes ei saa endale lubada umbes iga päev Solexa eksperimenti. Sekveneerimistehnoloogia täiustamine avab mõned uued uurimisuksed, kuid hästi rahastatud laborite jaoks on järjestuse piirangud juba astronoomiliselt kõrged. Siinkohal on uuema, parema sekveneerimistehnika import võimeline demokratiseerima füüsikateaduste ilmselt kõige esilekerkivamat haru. Murrangute järjestamine võib lubada uusi teaduslikke teadmisi, kuid tõenäolisemalt võimaldavad need mõnda aega omandatud teadmisi reaalses maailmas rakendada.

Kõik need artiklid, mida olete isikupärastatud meditsiini potentsiaali kohta lugenud? Selliseid järjestikuseid läbimurdeid tuleb jätkata, et need reaalsuseks muuta. Kuid erinevalt maailma grafeenidest ja ülijuhtidest järjestab tehnika järjestamine peaaegu vaieldamatult tahe sinna ja mitte aeglaselt. Niisiis, küsimuseks pole nüüd: 'Kuidas me järjestame rohkem DNA-d?' vaid pigem: 'Mida me saame nende jadadega teha, kui oleme need andnud võimalikult paljudesse kätesse?'



Vaadake meie 2007es.com Explains sarja, et saada põhjalikum ülevaade tänapäeva kuumimatest tehnikateemadest.

Copyright © Kõik Õigused Kaitstud | 2007es.com